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WB實驗:膜上一片空白怎么回事?
恒遠生物主要經(jīng)營科研試劑產(chǎn)品，現(xiàn)擁有各物種基因產(chǎn)品50余萬種；重組蛋白20余萬種；數(shù)十個種屬的多克隆抗體3萬多種和高質(zhì)量單克隆抗體數(shù)百種。恒遠品牌自主研發(fā)ELISA試劑盒，現(xiàn)已涵蓋20多個種屬，數(shù)千種產(chǎn)品，涉及腫瘤、激素、自身免疫、心血管、代謝等十多個研究領(lǐng)域。本周小編給大家?guī)淼氖牵篧B實驗結(jié)果——膜上一片空白，到底是什么原因?qū)е碌哪?？一起來看看吧?/span>
一、膠和膜放反了：如果在轉(zhuǎn)印的過程中，膠和膜的位置顛倒了，那么蛋白就從膠上轉(zhuǎn)移到緩沖液中，而不會到達膜上。對于標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)印，凝膠應(yīng)靠近三明治的負(fù)極，而膜對應(yīng)正極。
二、轉(zhuǎn)膜效率低：轉(zhuǎn)膜效率受多種因素影響，包括蛋白的大小、凝膠中丙烯酰胺的百分比、電場強度、轉(zhuǎn)印時間和緩沖液的PH值。一般來說，蛋白越大，轉(zhuǎn)移的越慢。轉(zhuǎn)移大蛋白最好的方法是用高的電場強度。而小蛋白長時間處于高電場強度下可能會傳出轉(zhuǎn)印膜。避免這個問題的方法是用0.2μm孔徑的PVDF膜進行轉(zhuǎn)印。如果蛋白的等電點接近緩沖液的pH值，那么這個蛋白攜帶的電荷很少，在電場中頁幾乎不移動。如果你的目的蛋白是強堿性的，那么你可以用碳酸鹽(pH9.9)、CAPS(pH11)及酸性緩沖液。
三、試劑放置太久或存放條件不正確：抗體會慢慢降解，如果反復(fù)凍融的話，它會快速降解。底物應(yīng)儲存在-20℃。
四、抗體不純或滴度太低：一抗的濃度差異很大，應(yīng)該根據(jù)經(jīng)驗來決定一抗的稀釋度。一般的原則是以1：100-1:1000來稀釋血清或組織培養(yǎng)上清，以1：1000-1：10000來稀釋腹水或超免疫動物的血清。Bio-Rad的印跡級別的二抗稀釋度是1：3000。
五、酶失活了：疊氮鈉是辣根過氧化物酶的抑制劑。不要再HRP顯色的western blot中使用任何含疊氮鈉的試劑。疊氮鈉可以用于堿性磷酸酶結(jié)合的抗體中，而無副作用。另外，只能使用蒸餾的去離子水。
六、使用Tween-20洗滌：Tween-20(吐溫-20)可能會干擾某些抗體-抗體相互作用，或洗去PVDF膜上的目的蛋白。因此除了封閉之后的第一次洗滌，其他洗滌過程中都不使用Tween-20。
七、檢測系統(tǒng)缺乏足夠的靈敏度：確保蛋白的上樣量在檢測系統(tǒng)的靈敏度范圍內(nèi)。
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