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質(zhì)粒轉(zhuǎn)化實驗操作步驟
1.基本原理
將質(zhì)粒 DNA 導(dǎo)入細菌的過程稱為轉(zhuǎn)化（ Transformation ）。此感受態(tài)細菌細胞在 CaCl 2 低滲溶液中膨脹為球狀。質(zhì)粒 DNA 與 CaCl 2 形成抗 DNase 羥基 - 磷酸鈣復(fù)合物黏附于細菌表面，經(jīng) 42℃ 短時間熱沖擊處理，促進細胞吸收 DNA 復(fù)合物。在豐富培養(yǎng)基上生長數(shù)小時后，球狀細胞復(fù)原并分裂增殖。被轉(zhuǎn)化的細菌中，外源基因得到表達。在選擇性培養(yǎng)平板上，可選出所需的轉(zhuǎn)化子（即含有質(zhì)粒 DNA 的細菌）。鈣處理的感受態(tài)細胞，一般每微克 DNA 能獲得 10 5 ～ 10 6 個轉(zhuǎn)化子。除化學(xué)方法轉(zhuǎn)化細菌外，還有電穿孔法（ Electroporation ），其轉(zhuǎn)化率可高達 10 9 ～ 10 10 個轉(zhuǎn)化子 /μg 質(zhì)粒 DNA 。
2.器材
①培養(yǎng)皿 ②恒溫培養(yǎng)箱
3.試劑
① LB 培養(yǎng)基
②選擇性 LB 瓊脂培養(yǎng)平板（含氨芐青霉素，終濃度為 50μg/ml ）
③氨芐青霉素 100 mg/ml
④宿主細菌：經(jīng) 100 mmol/L CaCl 2 處理的感受態(tài)細菌 DH5α
4.操作步驟
①取 50 μL 大腸桿菌感受態(tài)細胞，加入適量質(zhì)粒（體積不得超過 4 μL ）冰浴 30 min 后， 42℃ 熱激 90 s ，馬上放回冰上，冰浴 2 min ；
②加 400 μL LB 培養(yǎng)基，于 37℃ 搖床慢搖振蕩培養(yǎng) 45-60 min ；
③取 50-100 μL 涂在含有氨芐青霉素（ 100 μg/mL ）的 LB 固體培養(yǎng)基上， 37℃ 倒置培養(yǎng)過夜。
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